近日，國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)布《重組人源化膠原蛋白原材料評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則（2023年第16號(hào)）》，本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)醫(yī)療器械注冊(cè)?申請(qǐng)人對(duì)醫(yī)療器械所用重組人源化膠原蛋白原材料進(jìn)行充分的研究，并整理形成產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)重組人源化膠原蛋白制成的產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料包括所引用主文檔相關(guān)內(nèi)容的技術(shù)審評(píng)提供參考。
近日，國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)布《重組人源化膠原蛋白原材料評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則（2023年第16號(hào)）》，本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)醫(yī)療器械注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)醫(yī)療器械所用重組人源化膠原蛋白原材料進(jìn)行充分的研究，并整理形成產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)重組人源化膠原蛋白制成的產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料包括所引用主文檔相關(guān)內(nèi)容的技術(shù)審評(píng)提供參考。
重組人源化膠原蛋白原材料評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則
本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)醫(yī)療器械所用重組人源化膠原蛋白原材料進(jìn)行充分的研究，并整理形成產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)重組人源化膠原蛋白制成的產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料包括所引用主文檔相關(guān)內(nèi)容的技術(shù)審評(píng)提供參考。
本指導(dǎo)原則系對(duì)醫(yī)療器械用重組人源化膠原蛋白原材料的一般要求，適用于人膠原蛋白的所有型別，注冊(cè)申請(qǐng)人需依據(jù)具體醫(yī)療器械產(chǎn)品的特性對(duì)產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料涉及的原材料相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容的適用性。本指導(dǎo)原則不直接涉及重組人源化膠原蛋白原材料制成的醫(yī)療器械終產(chǎn)品的安全性或有效性評(píng)價(jià)，具體產(chǎn)品的評(píng)價(jià)請(qǐng)參考相應(yīng)的產(chǎn)品注冊(cè)審查指導(dǎo)原則。
本指導(dǎo)原則是對(duì)注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料；需在遵循相關(guān)法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的前提下使用本指導(dǎo)原則。
本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。
一、前言
近年來(lái)，隨著基因重組、蛋白質(zhì)組學(xué)等基礎(chǔ)理論、技術(shù)手段和臨床醫(yī)療探索研究的不斷發(fā)展，重組膠原蛋白日益成為重要的生物材料，為相關(guān)醫(yī)療器械的研發(fā)提供了新的思路與方法。重組人源化膠原蛋白是由DNA重組技術(shù)制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長(zhǎng)或部分氨基酸序列片段，或是含人膠原蛋白功能片段的組合。
重組人源化膠原蛋白僅是重組膠原蛋白的一類，材料特性并不能完全決定最終產(chǎn)品的安全性和有效性。本指導(dǎo)原則中的“原材料”是指用于生產(chǎn)制造醫(yī)療器械用的重組人源化膠原蛋白材料。除特別說(shuō)明外，本指導(dǎo)原則中的“材料”等同于“原材料”。
重組人源化膠原蛋白是通過(guò)基因工程生產(chǎn)的蛋白，工程細(xì)胞構(gòu)建過(guò)程、生產(chǎn)用細(xì)胞的質(zhì)量控制及常規(guī)生產(chǎn)過(guò)程控制是該原材料生產(chǎn)工藝及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)，此方面主要的驗(yàn)證資料，可參考本指導(dǎo)原則的資料性附件作為原材料研究資料的補(bǔ)充，但不作為產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料的必要內(nèi)容。結(jié)合重組人源化膠原蛋白的特點(diǎn)，該資料性附件修改引用了國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心《重組制品生產(chǎn)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)量控制技術(shù)評(píng)價(jià)一般原則》《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》等生物制品指導(dǎo)原則的相關(guān)內(nèi)容。
二、評(píng)價(jià)要點(diǎn)
（一） 重組人源化膠原蛋白原材料性能研究
為了確保重組人源化膠原蛋白原材料質(zhì)量可控，重組人源化膠原蛋白需參考相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行必要的鑒別、純度和雜質(zhì)等分析，可采用不同的分析方法對(duì)原材料的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸序列、各種翻譯后修飾（如脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾、脯氨酸羥基化等）進(jìn)行充分鑒定，并進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)，以確認(rèn)終產(chǎn)物具有擬宣稱的原材料構(gòu)象、聚集狀態(tài)、降解狀態(tài)及膠原蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)。
材料理化特性分析需按照醫(yī)療器械制備工藝和特點(diǎn)，結(jié)合其風(fēng)險(xiǎn)控制要求進(jìn)行相關(guān)研究，建議對(duì)如下常規(guī)理化項(xiàng)目進(jìn)行研究，例如氨基酸序列、蛋白空間結(jié)構(gòu)、劑型（如溶液、凍干粉、凝膠、纖維、海綿等）、膠原蛋白型別等特異性性能，同時(shí)結(jié)合醫(yī)療器械特點(diǎn)，完善理化性能指標(biāo)要求。
需根據(jù)不同的預(yù)期用途及使用部位、不同生產(chǎn)工藝、預(yù)期使用效果和最終醫(yī)療器械的狀態(tài)，選擇適用的指標(biāo)；根據(jù)膠原蛋白原材料是否經(jīng)過(guò)交聯(lián)或化學(xué)修飾，宜提供交聯(lián)劑或修飾劑的殘留量、降解性能等的研究，提供相應(yīng)的研究報(bào)告。
性能指標(biāo)的建立及驗(yàn)證取決于膠原蛋白原材料性質(zhì)和用途、生產(chǎn)和純化工藝及生產(chǎn)工藝的經(jīng)驗(yàn)等多種因素。新的分析技術(shù)及對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)正在不斷進(jìn)行，適當(dāng)時(shí)需使用這些新的技術(shù)。因現(xiàn)有技術(shù)原因而產(chǎn)生偏差的需進(jìn)行合理性解釋說(shuō)明。
1.鑒別
1.1氨基酸序列及覆蓋度
首先需明確氨基酸序列的選擇依據(jù)，如為特定氨基酸序列片段組成的，還需明確片段重復(fù)次數(shù)及依據(jù)。需采用綜合的方法測(cè)定目標(biāo)膠原蛋白原材料的氨基酸序列，并與其基因序列對(duì)應(yīng)的理論氨基酸序列進(jìn)行比較驗(yàn)證。肽段覆蓋率的檢測(cè)結(jié)果需為100%覆蓋，末端氨基酸序列檢測(cè)結(jié)果需與理論序列完全一致?？砂凑铡吨亟M人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，直接使用供試品檢測(cè)，并選擇適宜的酶解條件進(jìn)行水解，酶解后選擇不小于5個(gè)連續(xù)氨基酸的片段為基本的序列單元進(jìn)行覆蓋分析。
如適用，目標(biāo)膠原蛋白材料的理論氨基酸序列需包括二硫鍵連接方式。氨基酸序列測(cè)定還需考慮可能存在的N端甲硫氨酸（如大腸桿菌來(lái)源的膠原蛋白原材料），信號(hào)肽或前導(dǎo)序列。
1.1.1氨基酸組成
使用各種水解法和分析手段測(cè)定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸組成或天然異構(gòu)體比較。如需要時(shí)需考慮分子量的大小。多數(shù)情況下，氨基酸組成分析對(duì)肽段和小蛋白可提供有價(jià)值的結(jié)構(gòu)資料，但對(duì)大蛋白一般意義較小。在多數(shù)情況下，氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于確定蛋白含量。
1.1.2氨基酸末端序列
氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質(zhì)和同質(zhì)性。用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法測(cè)定N端和/或C端氨基酸序列，其結(jié)果需符合理論預(yù)測(cè)。
若發(fā)現(xiàn)目的膠原蛋白材料的末端氨基酸發(fā)生改變時(shí)，需使用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄闻卸ㄗ儺愺w的相應(yīng)變異數(shù)量。需將這些氨基酸末端序列與來(lái)自目的膠原蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列進(jìn)行比較。
1.2肽圖
按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部 通則 肽圖檢查法 第一法 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，建立膠原蛋白原材料標(biāo)準(zhǔn)肽圖。
推薦利用四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-TOF MS）建立標(biāo)準(zhǔn)肽圖，作為膠原蛋白材料的指紋圖譜，用于材料的批間一致性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，以及材料特異性的鑒別。
需用合適的酶或化學(xué)試劑使所選的材料片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽，應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠?。盡量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)，N-末端測(cè)序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。至少對(duì)材料成品放行來(lái)說(shuō),經(jīng)驗(yàn)證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的材料結(jié)構(gòu)/鑒別的適當(dāng)方法。具體分析方法可參考《重組膠原蛋白肽圖指紋圖譜分析》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
1.3分子量
對(duì)申報(bào)醫(yī)療器械所用膠原蛋白材料可參照《中華人民共和國(guó)藥典》高效液相色譜法、“電泳法”的“第五法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法”、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜方法建立分子量及分布檢測(cè)方法，也可以運(yùn)用其他適當(dāng)技術(shù)測(cè)定分子量，如分子排阻色譜法等。需通過(guò)至少一種合理的、經(jīng)驗(yàn)證的方法證明其實(shí)際分子量與理論預(yù)測(cè)一致。
高效液相色譜法目標(biāo)蛋白的出峰保留時(shí)間需與參比品一致；高分辨質(zhì)譜法分子量需與參比品一致；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分子量電泳條帶位置需與參比品一致。同時(shí)，需就參比品的選擇提供合理性依據(jù)。
1.4等電點(diǎn)
按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 電泳法第六法（等電聚焦電泳法）或0542毛細(xì)管電泳法進(jìn)行檢測(cè)，等電點(diǎn)需在標(biāo)示范圍內(nèi)，也可以運(yùn)用其他適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定。
1.5巰基和二硫鍵
如果目的膠原蛋白材料的基因序列存在半胱氨酸殘基時(shí)，需盡可能確定巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質(zhì)譜測(cè)定法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>
1.6消光系數(shù)（或克分子吸光度）
多數(shù)情況下，可取目的膠原蛋白材料于UV/可見(jiàn)光波長(zhǎng)處測(cè)定消光系數(shù)（或克分子吸光度）。消光系數(shù)的測(cè)定為使用UV/可見(jiàn)光或分光光度計(jì)檢測(cè)已知蛋白含量的溶液，蛋白含量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)或定氮法等方法測(cè)定。
1.7電泳圖型
應(yīng)用PAGE電泳、等電聚焦、SDS－PAGE電泳、免疫印跡、毛細(xì)管電泳法或其他適當(dāng)?shù)姆椒?獲得目的膠原蛋白材料的一致性，同一性和純度的電泳圖譜和數(shù)據(jù)。
1.8液相色譜圖譜
應(yīng)用分子篩色譜、反相液相色譜、離子交換液相色譜、親和色譜或其他適當(dāng)方法，獲得目的膠原蛋白材料的一致性、同一性和純度的色譜圖譜和數(shù)據(jù)。
2.結(jié)構(gòu)表征
2.1脯氨酸羥基化
若在設(shè)計(jì)時(shí)進(jìn)行脯氨酸羥基化，需按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的要求進(jìn)行分析，并規(guī)定標(biāo)示值。
2.2高級(jí)結(jié)構(gòu)分析
鑒于高級(jí)結(jié)構(gòu)與重組人源化膠原蛋白表現(xiàn)出的性能和功能密切相關(guān)，若材料擬宣稱具有相應(yīng)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，采用多種方法對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究分析，包括以下列舉的方法及其他結(jié)構(gòu)表征方法，如冷凍電鏡、蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)等方法。
2.2.1三螺旋結(jié)構(gòu)分析
可采用圓二色譜在特定常規(guī)試驗(yàn)條件下的檢測(cè)重組人源化膠原蛋白的CD光譜特征。若采用特定的非常規(guī)條件檢測(cè)，則檢測(cè)結(jié)果僅反映膠原蛋白材料在該條件下可（否）具有形成類似膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的CD光譜特征能力；此時(shí)需分析并闡述所檢測(cè)樣品是否代表“原材料樣品”，還是“原材料樣品”的特定處理（后續(xù)加工）樣品。同時(shí)建議進(jìn)行最低檢出限分析，其結(jié)果需與生理性膠原蛋白相近（相差不超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)）?？刹捎肵射線晶體學(xué)技術(shù)或冷凍電鏡技術(shù)在原子結(jié)構(gòu)水平考證膠原蛋白材料或其包含的特定氨基酸序列的三螺旋結(jié)構(gòu)特性，計(jì)算有結(jié)構(gòu)信息的序列占整個(gè)蛋白序列的百分比；可采用差示掃描量熱法檢測(cè)膠原蛋白材料結(jié)構(gòu)變化的熱效應(yīng)輔助說(shuō)明膠原蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)特征；可采用紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，其非特征區(qū)（如：酰胺a、b）和特征區(qū)（如：酰胺I、酰胺II、酰胺III）的特征峰位置需與參比品一致；可采用拉曼光譜，其拉曼光譜圖需與參比品一致；也可應(yīng)用其它紫外或可見(jiàn)光吸收光譜法、核磁共振（NMR）等適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)。
2.2.2纖維質(zhì)量/多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表征
若材料預(yù)期形成纖維/網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)時(shí)，宜使用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）或原子力顯微鏡（AFM）等方法觀察膠原蛋白材料形成膠原纖維束/多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等，需明確兩種方法具體的制樣和觀察測(cè)定過(guò)程。與此相關(guān)的膠原分子自組裝和聚合能力分析，可參考相關(guān)國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。
3.純度
關(guān)于純度的要求可根據(jù)醫(yī)療器械終產(chǎn)品的用途和用法而確定。存在二硫鍵時(shí)重組人源化膠原蛋白可能會(huì)形成寡聚體，且其電泳分子量大小需成倍增加，寡聚體需視為重組人源化膠原蛋白而非雜質(zhì)。
4.含量
需建立重組人源化膠原蛋白含量檢測(cè)方法，含量以質(zhì)量/重量或質(zhì)量/體積表示。含量檢測(cè)可通過(guò)液相色譜法（HPLC）、凱氏定氮法、特征多肽法等。
5.雜質(zhì)、污染物和添加劑
對(duì)膠原蛋白材料工藝相關(guān)雜質(zhì)以及外源污染物等進(jìn)行研究，如：細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源、細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)源和下游工藝。需對(duì)潛在的工藝相關(guān)雜質(zhì)（如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞DNA、細(xì)胞培養(yǎng)殘留物、下游工藝的殘留物等）進(jìn)行鑒別、評(píng)估，并進(jìn)行定性和/或定量分析，并采用適宜的方法評(píng)價(jià)其對(duì)生物學(xué)功能的影響。工藝相關(guān)雜質(zhì)來(lái)源于生產(chǎn)工藝，可分三大類：來(lái)源于細(xì)胞基質(zhì)、培養(yǎng)基和下游工藝。細(xì)菌內(nèi)毒素、微生物限度和無(wú)菌性，是常規(guī)的污染物控制要求。
5.1源于細(xì)胞基質(zhì)的雜質(zhì)
來(lái)源于細(xì)胞基質(zhì)的雜質(zhì)包括源于宿主生物體的蛋白/多肽；核酸（宿主細(xì)胞/載體/總DNA）；多糖及病毒。對(duì)于宿主細(xì)胞蛋白，一般需用能檢測(cè)出較寬范圍蛋白雜質(zhì)的靈敏的免疫檢測(cè)方法。需用不含目的基因的生物體粗提物，即不含膠原蛋白編碼基因的生產(chǎn)用細(xì)胞，制備上述試驗(yàn)使用的多克隆抗體?？赏ㄟ^(guò)對(duì)膠原蛋白材料的直接分析方法（如雜交技術(shù)法）檢測(cè)宿主細(xì)胞的DNA水平，和/或通過(guò)標(biāo)記試驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)室規(guī)模）檢測(cè)證實(shí)通過(guò)純化工藝能去除核酸。對(duì)于有意導(dǎo)入的病毒，需驗(yàn)證生產(chǎn)工藝中去除/滅活病毒的能力。
5.1.1外源性DNA殘留量
按照《中華人民共和國(guó)藥典》“外源性DNA殘留量測(cè)定法”的“熒光染色法”或“定量PCR法”進(jìn)行測(cè)定，“熒光染色法”的樣品加標(biāo)回收率需滿足70%～130%；“定量PCR法”的樣品加標(biāo)回收率需滿足50%～150%，需規(guī)定殘留限量。如果樣品中外源性DNA殘留量低于“熒光染色法”的檢測(cè)限，則需采用“定量PCR法”進(jìn)行測(cè)定。
需根據(jù)醫(yī)療器械產(chǎn)品的預(yù)期臨床用途、使用量等，確定含重組人源化膠原蛋白的材料臨床最大使用量的外源性DNA殘留量限值。推薦參考生物制品外源性DNA殘留限量要求，結(jié)合殘留DNA宿主類型及其風(fēng)險(xiǎn)程度設(shè)定每人每次最大使用量限值。
建議參考生物制品中大腸桿菌或酵母菌表達(dá)的基因工程重組生物制品的外源性DNA殘留量限度。
5.1.2宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量
5.1.2.1大腸桿菌蛋白質(zhì)殘留量
按照《中華人民共和國(guó)藥典》“大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法”或采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
5.1.2.2酵母蛋白質(zhì)殘留量
按照《中華人民共和國(guó)藥典》“酵母工程菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法”或采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
5.1.2.3CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量
采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
5.1.3促炎性污染物（肽聚糖）
采用經(jīng)驗(yàn)證的方法或經(jīng)驗(yàn)證的市售細(xì)菌肽聚糖檢測(cè)試劑盒（ELISA）檢測(cè)殘留肽聚糖，需根據(jù)其致熱反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)規(guī)定可接受的限量要求。
5.1.4碳水化合物結(jié)構(gòu)
根據(jù)細(xì)胞基質(zhì)等因素，必要時(shí)需考慮測(cè)定糖蛋白中碳水化合物的含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外，盡可能分析碳水化合物的結(jié)構(gòu)、寡糖形態(tài)（長(zhǎng)鏈狀）和多肽的糖基化位點(diǎn)。
5.2源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)
來(lái)源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)包括誘導(dǎo)劑（多核苷酸，病毒）、抗生素、血清及其他培養(yǎng)基組分。需根據(jù)工藝中采用的表達(dá)體系和使用的抗生素類型，采用經(jīng)驗(yàn)證的方法測(cè)定殘余抗生素含量/活性，殘余抗生素含量需符合《重組人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，不應(yīng)有殘余抗生素活性。
殘余抗生素含量的測(cè)定按照YY/T 1849《重組膠原蛋白》中描述的方法或其他經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行檢測(cè)，殘余抗生素活性按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 生物活性測(cè)定法中抗生素微生物檢定法或《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 抗生素殘留量檢查法進(jìn)行檢測(cè)。
5.3源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)
來(lái)源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)一般包括酶、化學(xué)/生化處理試劑（如溴化氰、胍、氧化劑和還原劑）、無(wú)機(jī)鹽（如重金屬、砷、非有色金屬離子）、溶劑、載體/配體（如單克隆抗體），及其他可濾過(guò)的物質(zhì)。需結(jié)合實(shí)際情況制定相關(guān)理化指標(biāo)。
5.3.1添加劑
如果使用了防腐劑、凍干保護(hù)劑等添加劑，需給出其限量要求和檢測(cè)方法。
5.3.2重金屬及微量元素含量需符合以下規(guī)定。
5.3.2.1重金屬元素
對(duì)工藝中添加的重金屬元素，需符合規(guī)定限值。
5.3.2.2重金屬含量
重金屬總量（以Pb計(jì)）需符合YY/T 1888《重組人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的限值。
5.3.2.3微量元素含量
微量元素含量：砷（As）、汞（Hg）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、鎘（Cd）、銅（Cu）、鉬（Mo）、鐵（Fe）、鎳（Ni）需符合YY/T 1888《重組人源化膠原蛋白》等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的要求。
5.4細(xì)菌內(nèi)毒素
細(xì)菌內(nèi)毒素相關(guān)限量要求需考慮醫(yī)療器械終產(chǎn)品與人體的接觸方式。
5.5微生物限度
若重組人源化膠原蛋白材料以微生物限度控制狀態(tài)提供，按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法和非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果需符合相關(guān)要求。
5.6無(wú)菌
若重組人源化膠原蛋白材料以無(wú)菌狀態(tài)提供，按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 無(wú)菌檢查法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果需無(wú)菌。
5.7分子變異體
需對(duì)重組人源化膠原蛋白材料的各種分子變異體進(jìn)行分離、鑒別和分析。如變異體的功能與目標(biāo)產(chǎn)物一致時(shí)可不做雜質(zhì)考慮。需考慮在生產(chǎn)和/或貯存期間膠原蛋白材料降解產(chǎn)物是否顯著增加及其與免疫原性的相關(guān)性。以下為最常見(jiàn)的目的膠原蛋白材料的分子變異體，并列出了相應(yīng)的檢測(cè)方法。
5.7.1化學(xué)修飾類型
各種非預(yù)期的翻譯后修飾是導(dǎo)致重組蛋白異質(zhì)性的重要質(zhì)量問(wèn)題，如：脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾等和其他可能的N端、C端修飾（如乙酰化、酰胺化或者由于外肽酶導(dǎo)致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等），以及各種其他異質(zhì)性（如異構(gòu)化、碎片化、二硫鍵錯(cuò)配、N-連接和O-連接的寡糖、聚集等）。適用時(shí)，需按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的要求，參照《重組膠原蛋白肽圖指紋圖譜分析》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。需考慮脫酰胺、異構(gòu)化、錯(cuò)配二硫鍵連接和氧化形式的分離和鑒別。對(duì)這些變異體的分離和鑒別，可采用層析法、電泳法（如毛細(xì)管電泳）、質(zhì)譜法和/或光譜法（如圓二色譜）。需注意在修飾不會(huì)引起或只引起較小的分子量變化及結(jié)構(gòu)變化的情況下，這些方法可能無(wú)法鑒別。此時(shí)，需要結(jié)合功能性試驗(yàn)，評(píng)價(jià)所發(fā)生的修飾是否影響預(yù)期的功能和使用。
5.7.2降解物和聚合體
降解物和聚合體：聚合體包括二聚體和多聚體，可用分子篩層析法（如SE-HPLC）進(jìn)行定量；需建立成品中非預(yù)期降解物的判定標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)穩(wěn)定性試驗(yàn)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
6.熱穩(wěn)定性
如果重組人源化膠原蛋白是多聚體，可采用差示掃描量熱分析（DSC）進(jìn)行解聚溫度分析?？蓞⒖肌吨腥A人民共和國(guó)藥典》 四部。
如果是單鏈的蛋白肽，可參考《中華人民共和國(guó)藥典》 四部，人免疫球蛋白3.3.2.4熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，將供試品置（57±0.5）℃水浴中保溫4h后，用可見(jiàn)異物檢查裝置，肉眼觀察需無(wú)凝膠化或絮狀物。
7.其它理化指標(biāo)
膠原蛋白材料其它性能指標(biāo)宜根據(jù)醫(yī)療器械終產(chǎn)品特性及相關(guān)通用要求制定，在適用時(shí)，需對(duì)相關(guān)性能指標(biāo)檢測(cè)方法使用的參比品進(jìn)行性能研究，對(duì)照品技術(shù)參數(shù)需明確且性能穩(wěn)定。用于理化測(cè)定等方面的參比品，需進(jìn)行必要的分析鑒定，包括但不限于：
7.1外觀（如性狀、顏色）
用肉眼直接觀測(cè)，需為白色/淡黃色/無(wú)色透明液體或凝膠，或白色/類白色凍干粉或海綿狀固體。
注：隨著行業(yè)發(fā)展，可能存在其他外觀要求，需根據(jù)原材料具體形態(tài)規(guī)定外觀要求。
7.2可見(jiàn)異物
按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 可見(jiàn)異物檢查法第一法（燈檢法）進(jìn)行檢測(cè)，需無(wú)明顯異物。
7.3溶解性
需根據(jù)供試品的溶解特性，對(duì)供試品在水、稀酸或中性鹽溶液中的溶解程度進(jìn)行表征和闡述。
7.4水分
適用時(shí)（如凍干樣品），需明確水分含量。除另有規(guī)定外，取供試品約1g～2g，按照《中華人民共和國(guó)藥典》“水分測(cè)定法”第二法（烘干法）測(cè)定，或取供試品約10mg按照《中華人民共和國(guó)藥典》“熱分析法”熱重法（TG）測(cè)定，升溫程序：從室溫以10℃/min速率升溫至105℃，保持60min。減失重量需符合所標(biāo)示范圍。規(guī)定仲裁方法為水分測(cè)定法。
7.5熾灼殘?jiān)?/p>
除另有規(guī)定外，取1.0-2.0g，按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 熾灼殘?jiān)鼨z查法進(jìn)行檢測(cè)。
7.6酸堿度
液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL，按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則“pH值測(cè)定法”進(jìn)行檢測(cè)，需符合所標(biāo)示值的±1.0。
7.7滲透壓摩爾濃度
適用時(shí)，液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 滲透壓摩爾濃度測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)，滲透壓摩爾濃度范圍需符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。
7.8動(dòng)力黏度（凝膠）
取供試品按照《中華人民共和國(guó)藥典》“黏度測(cè)定法”的“旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)定法”測(cè)定，需要詳細(xì)描述試驗(yàn)條件，動(dòng)力黏度值需符合所標(biāo)示范圍。
7.9裝量及差異
根據(jù)供試品性狀（溶液、凝膠、凍干海綿或凍干粉末等）和裝量的不同確定裝量的允差要求。例如：20g（mL）以下，單個(gè)裝量不低于標(biāo)示裝量的93%；20g（mL）至50g（mL），單個(gè)裝量不低于標(biāo)示裝量的95%；50g（mL）以上，單個(gè)裝量不低于標(biāo)示裝量的97%；平均裝量不低于標(biāo)示裝量。
8.降解特性及產(chǎn)物
需對(duì)膠原蛋白材料降解特性進(jìn)行研究，可采用凝膠滲透色譜（GPC）測(cè)定降解產(chǎn)物的分子量分布及分子量，水解/酶解產(chǎn)物可使用氨基酸分析儀、高效液相色譜或其他適宜的方法測(cè)定。
9.生物學(xué)功能評(píng)價(jià)
重組膠原蛋白的生物學(xué)功能是指以重組膠原蛋白生物學(xué)特性相關(guān)屬性為基礎(chǔ)的生物學(xué)作用，對(duì)聲稱的生物學(xué)功能宜進(jìn)行定性定量分析。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，重組人源化膠原蛋白作為重組膠原蛋白的一種，其主要生物學(xué)功能也同樣是為細(xì)胞提供支架和良好的微環(huán)境，如促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、生長(zhǎng)、分化等。因此，可通過(guò)評(píng)價(jià)細(xì)胞-膠原蛋白相互作用來(lái)評(píng)價(jià)重組人源化膠原蛋白的生物學(xué)功能。細(xì)胞增殖、分化、黏附性、遷移或移行評(píng)價(jià)方法可參考YY/T 1849《重組膠原蛋白》。
由于膠原類材料在分子組成、微結(jié)構(gòu)、物理性能方面可能差異顯著，需檢測(cè)材料與細(xì)胞之間相互作用及其引導(dǎo)細(xì)胞基礎(chǔ)響應(yīng)的性能。細(xì)胞響應(yīng)的參數(shù)包括細(xì)胞形態(tài)、面積和體積，均可通過(guò)二維（2D）或三維（3D）圖像技術(shù)可視化評(píng)價(jià)，還包括存活率、增殖率、程序化凋亡以及遷移。
鼓勵(lì)對(duì)重組人源化膠原蛋白對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)理進(jìn)行研究。例如，抗體阻斷試驗(yàn)可用來(lái)確定細(xì)胞表面的何種受體參與了與膠原的作用，如整合素或盤狀結(jié)構(gòu)域受體（DDRs）。此外，細(xì)胞骨架成分（如肌動(dòng)蛋白）的協(xié)同作用也可用來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞與基質(zhì)間的粘附與收縮解離。有多種在單細(xì)胞或多細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)細(xì)胞引導(dǎo)的收縮解離的方法，包括自由漂浮組織構(gòu)建物的尺寸隨時(shí)間的變化、施加在培養(yǎng)-力學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)上力的大小，以及單個(gè)細(xì)胞在膠原網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)力和形變等。
其它適用于干細(xì)胞和祖細(xì)胞類型的細(xì)胞-膠原相互作用的功能性檢測(cè)包括細(xì)胞株的定向分化，特定干細(xì)胞或祖細(xì)胞的增殖，或組織形態(tài)發(fā)生（始于內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管形成）。按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部 進(jìn)行成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性測(cè)定，對(duì)膠原蛋白肽-細(xì)胞相互作用評(píng)價(jià)，反映膠原蛋白肽與成纖維細(xì)胞增殖的構(gòu)效關(guān)系。
按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部 生物活性測(cè)定法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括對(duì)驗(yàn)證指標(biāo)結(jié)果的繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以及判斷其是否符合可接受標(biāo)準(zhǔn)等。常規(guī)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法一般要求數(shù)據(jù)之間相互獨(dú)立，并呈近似正態(tài)分布和方差齊性，通常采用相對(duì)效價(jià)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)無(wú)法滿足上述統(tǒng)計(jì)學(xué)要求時(shí)，也可考慮采用其他適宜的替代方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
上述關(guān)于膠原—細(xì)胞相互作用的功能性測(cè)定也可作為醫(yī)療器械產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的方法。三維支架材料中細(xì)胞活性評(píng)價(jià)方法可參考YY/T 1562《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 生物材料支架 細(xì)胞活性試驗(yàn)指南》。
（二） 材料免疫學(xué)安全性研究
臨床前安全性評(píng)價(jià)包括臨床前安全性試驗(yàn)，其目的主要是確定新膠原蛋白材料是否會(huì)在人體引起未能預(yù)料的不良反應(yīng)，免疫學(xué)安全性研究是重組人源化膠原蛋白材料生物安全性研究資料的主體。但是，用傳統(tǒng)生物試驗(yàn)方法來(lái)評(píng)價(jià)重組人源化膠原蛋白往往有困難，并受多種因素的影響。例如高度的種屬特異性，人的蛋白質(zhì)對(duì)人的生物學(xué)活性遠(yuǎn)高于對(duì)動(dòng)物的活性，而且人的蛋白質(zhì)氨基酸序列，常常與來(lái)自其它種系的蛋白質(zhì)不同，例如糖基。因而由基因工程技術(shù)所制備的蛋白質(zhì)或肽類往往會(huì)在人體以外的其它宿主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其生物學(xué)效應(yīng)有所改變，并可能因形成免疫復(fù)合物而導(dǎo)致有毒性反應(yīng)，而這樣產(chǎn)生的毒性反應(yīng)與人體安全性顯然無(wú)關(guān)。
另外，由于重組人源化膠原蛋白功能、生產(chǎn)工藝或者膠原蛋白材料穩(wěn)定性等要求，對(duì)膠原蛋白材料進(jìn)行修飾或者改構(gòu)，需提供與未修飾或者改構(gòu)材料比較的研究資料。以簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝為目的而引入的額外多肽片段如His-tag，在最終的材料成品中需符合相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。
1.免疫原及免疫化學(xué)檢驗(yàn)
基于部分人膠原蛋白核酸序列進(jìn)行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，特別是長(zhǎng)期反復(fù)使用時(shí)，可能引起人體預(yù)測(cè)不到的免疫原性。因此，不能完全排除其免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，宜增加免疫學(xué)研究。重組人源化膠原蛋白作為醫(yī)療器械用原材料，可采用適宜方法進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)。若用動(dòng)物進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)，可能因?yàn)閯?dòng)物模型與臨床應(yīng)用之間存在種屬差異，帶來(lái)對(duì)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果或評(píng)價(jià)試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用上的局限，需要根據(jù)臨床評(píng)價(jià)獲得的免疫學(xué)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)及動(dòng)物模型獲得的免疫評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析。
患者對(duì)蛋白質(zhì)類材料產(chǎn)生免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)將隨醫(yī)療器械產(chǎn)品變化而變化。建議采用基于風(fēng)險(xiǎn)的方法來(lái)評(píng)價(jià)和減輕與影響人源化膠原蛋白安全性和有效性相關(guān)的免疫應(yīng)答。人源化膠原免疫原主要源自生產(chǎn)過(guò)程中殘留的可致免疫原性的各種因子，包括殘留的各種雜蛋白（包括DNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中可能產(chǎn)生的異種蛋白）、殘留的大腸桿菌及酵母菌外源性DNA、材料致熱原、生產(chǎn)過(guò)程中菌體產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素、DAMPs以及人源膠原特異性免疫等等。
為降低人源化膠原蛋白材料的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，一般需在材料設(shè)計(jì)及生產(chǎn)工藝中采取相應(yīng)處理措施以降低其免疫原性，如宿主細(xì)胞選擇，蛋白提取、蛋白純化。注冊(cè)申請(qǐng)人需對(duì)其降低材料免疫原性的有效性進(jìn)行驗(yàn)證，并提供驗(yàn)證試驗(yàn)性數(shù)據(jù)或相關(guān)研究資料。注冊(cè)申請(qǐng)人需提供免疫原性檢測(cè)范例的理論依據(jù)，需使用經(jīng)完全驗(yàn)證的檢測(cè)法對(duì)來(lái)自關(guān)鍵性研究的樣品進(jìn)行檢測(cè)，并提供支持該檢測(cè)法的全面驗(yàn)證的數(shù)據(jù)。
雜蛋白的檢測(cè)可參考YY/T 1453《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 I型膠原蛋白表征方法》，外源性DNA檢測(cè)可參考YY/T 0606.25《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第25部分 動(dòng)物源性生物材料DNA殘留量測(cè)定法：熒光染色法》。膠原蛋白材料的免疫原檢驗(yàn)可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（FCM）或酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定，檢測(cè)試驗(yàn)宜考慮，但不限于淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（YY/T 0606.15《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第15部分 評(píng)價(jià)基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的試驗(yàn)方法：淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)》）、細(xì)胞遷移試驗(yàn)（YY/T 0606.20《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第20部分：評(píng)價(jià)基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的試驗(yàn)方法：細(xì)胞遷移試驗(yàn)》），采用非標(biāo)方法時(shí)需進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。
免疫原性檢測(cè)可設(shè)計(jì)為檢測(cè)不期望的生物或生理結(jié)果的抗體，重組人源化膠原蛋白抗體可能降低效果或者引起過(guò)敏等反應(yīng)?？贵w檢測(cè)的免疫原試驗(yàn)可參考《中華人民共和國(guó)藥典》，選擇適宜的方法進(jìn)行，包括橋聯(lián)或均相酶免疫法、放射免疫沉淀試驗(yàn)等，并進(jìn)行相關(guān)的方法開(kāi)發(fā)和試驗(yàn)驗(yàn)證。試驗(yàn)過(guò)程中，可根據(jù)滴度試驗(yàn)和中和活性試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)ADA進(jìn)行分析，還可進(jìn)行額外的抗體特征分析，包括抗體分型、抗原表位鑒定及交叉反應(yīng)評(píng)價(jià)。
篩選檢測(cè)法（也稱為結(jié)合抗體（BAb）檢測(cè)法）用于檢測(cè)與材料結(jié)合的所有抗體。使用確證性檢測(cè)法建立BAb對(duì)材料的特異性，使用滴定和中和檢測(cè)法進(jìn)一步表征重組人源化膠原蛋白抗體。使用滴定檢測(cè)法表征抗體應(yīng)答的量級(jí)，抗體對(duì)安全性和有效性的影響可能與其滴度和持續(xù)性而不是發(fā)生率相關(guān)。中和檢測(cè)法評(píng)估抗體干擾材料-靶標(biāo)相互作用的能力。中和抗體（NAb）是BAb的亞類，ADA對(duì)安全性和有效性的影響可能與NAb活性而不是抗體發(fā)生率相關(guān)。類似地，在一些情況下可能重要的是確定NAb滴度。用于檢測(cè)抗體的首選檢測(cè)法應(yīng)當(dāng)是檢測(cè)低親和力和高親和力抗體的高靈敏度篩選檢測(cè)法。注冊(cè)申請(qǐng)人在開(kāi)發(fā)檢測(cè)方法以確認(rèn)重組人源化膠原蛋白特異性抗體結(jié)合時(shí)，需選擇合適的確證性檢測(cè)法以防止抗體假陽(yáng)性數(shù)據(jù)，這些假陽(yáng)性數(shù)據(jù)會(huì)混淆抗體對(duì)安全性和有效性影響的分析。
注冊(cè)申請(qǐng)人需提供支持該檢測(cè)法的全面驗(yàn)證的數(shù)據(jù)。驗(yàn)證包括證明用于給定樣品中抗體的定量測(cè)量的特定檢測(cè)法對(duì)于預(yù)期用途是可靠和可重現(xiàn)的。抗體檢測(cè)法有助于評(píng)價(jià)材料的免疫原性，然而抗體的檢測(cè)依賴于檢測(cè)法的關(guān)鍵操作參數(shù)（如靈敏度、專屬性），一般來(lái)說(shuō)，建議注冊(cè)申請(qǐng)人開(kāi)發(fā)針對(duì)靈敏度、專屬性、選擇性、精確度、重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行優(yōu)化后的檢測(cè)法。
其他的免疫原評(píng)價(jià)及生物學(xué)性能及生物相容性評(píng)價(jià)等建議做醫(yī)療器械終產(chǎn)品的檢測(cè)，因?yàn)榧庸すに嚥煌罱K產(chǎn)品性能不同，例如有些交聯(lián)工藝可能會(huì)封閉某些免疫原反應(yīng)簇等等。
2.免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)
當(dāng)擬生產(chǎn)醫(yī)療器械免疫原性風(fēng)險(xiǎn)與已上市產(chǎn)品無(wú)可比性，且無(wú)充分的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)其免疫原性，需進(jìn)行免疫毒理學(xué)試驗(yàn)研究。通過(guò)免疫毒理學(xué)試驗(yàn)，對(duì)炎癥反應(yīng)、免疫抑制、免疫刺激、超敏反應(yīng)以及自身免疫進(jìn)行確證評(píng)價(jià)，評(píng)估免疫系統(tǒng)改變導(dǎo)致的潛在人體不良健康作用。
免疫毒理學(xué)可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（FCM）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、組織病理切片等方法測(cè)定，試驗(yàn)方法可考慮結(jié)合生物學(xué)試驗(yàn)、體外T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（YY/T 1465.1《醫(yī)療器械免疫原性評(píng)價(jià)方法 第1部分 體外T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)》）等，注冊(cè)申請(qǐng)人需對(duì)選用檢測(cè)方法的適用性進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用非標(biāo)方法時(shí)需進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。
可參考GB/T 16886.20《醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗(yàn)原則和方法》選擇性進(jìn)行功能性或非功能性免疫毒理學(xué)試驗(yàn)，通過(guò)嚙齒動(dòng)物試驗(yàn)方式檢測(cè)和評(píng)價(jià)物質(zhì)的不良作用。目前主要研究方法是將醫(yī)療器械/材料植入小鼠/模式小鼠，然后研究器械/材料整個(gè)降解周期內(nèi)機(jī)體的體液和細(xì)胞的免疫應(yīng)答，以及局部組織的免疫反應(yīng)。功能性檢測(cè)測(cè)定細(xì)胞和/或器官活性，例如淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原或特異性抗原的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性和特異性抗體的形成；非功能性檢測(cè)涵蓋形態(tài)學(xué)方面和/或定量的術(shù)語(yǔ)、淋巴組織變化程度、淋巴細(xì)胞數(shù)目和免疫球蛋白水平或其他免疫功能標(biāo)志物。
（三） 材料生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)
作為制備醫(yī)療器械產(chǎn)品的原材料，需參照GB/T 16886.1的要求對(duì)重組人源化膠原蛋白原材料進(jìn)行必要的生物學(xué)評(píng)價(jià)，尤其通過(guò)膠原蛋白材料到醫(yī)療器械終產(chǎn)品的加工工藝分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)相近時(shí)。如預(yù)期用于植入產(chǎn)品的原材料，還需評(píng)估樣品是否為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)激活物。若醫(yī)療器械終產(chǎn)品與膠原蛋白材料的使用方法不一致，需考慮生物學(xué)補(bǔ)充研究。
根據(jù)GB/T 42062《醫(yī)療器械 風(fēng)險(xiǎn)管理對(duì)醫(yī)療器械的應(yīng)用》描述的風(fēng)險(xiǎn)管理過(guò)程進(jìn)行生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)定，識(shí)別材料、添加劑、加工助劑和其他潛在可瀝濾物中的危害，接觸劑量等因素，繪制基于風(fēng)險(xiǎn)管理的生物學(xué)評(píng)價(jià)流程圖。
如果醫(yī)療器械產(chǎn)品以非滅菌的方式提供，可將樣品滅菌后用于生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)，需考慮滅菌方式及滅菌對(duì)重組人源化膠原蛋白的影響。
可能需要評(píng)價(jià)的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)定終點(diǎn)包括但不限于：
1.細(xì)胞毒性
2.致敏性
注射膠原、膠原止血?jiǎng)┑染哂袧撛谏锟山到庑圆牧?，或體內(nèi)植入材料以及材料制備過(guò)程中新增了化學(xué)成分和制造加工助劑、裝配粘合劑/溶劑殘留物，以及成品中可能存在滅菌殘留物或滅菌過(guò)程所致的反應(yīng)性產(chǎn)物時(shí)，需進(jìn)行遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)。
3.皮膚刺激性
4.皮內(nèi)反應(yīng)
注射膠原、膠原止血?jiǎng)┑染哂袧撛谏锟山到庑圆牧匣蝮w內(nèi)植入材料以及材料制備過(guò)程中新增化學(xué)成分和制造加工助劑、裝配粘合劑/溶劑殘留物以及滅菌殘留物或滅菌過(guò)程所致的反應(yīng)性產(chǎn)物可能存在于成品時(shí)需進(jìn)行皮內(nèi)刺激試驗(yàn)。
5.材料介導(dǎo)的致熱性
6.全身毒性
7.溶血性
血管修復(fù)材料、創(chuàng)傷和燒傷修復(fù)材料、膠原止血?jiǎng)?、心臟瓣膜等與循環(huán)血液接觸的外部接入材料和大部分植入材料以及全部植入血管系統(tǒng)材料需進(jìn)行溶血試驗(yàn)。
8.植入反應(yīng)
皮下植入（膠原支架、血管修復(fù)材料、創(chuàng)傷和燒傷修復(fù)材料、膠原止血?jiǎng)┑瓤山到?可吸收材料或需植入生物材料等需進(jìn)行皮下組織植入試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)）；肌肉植入；骨植入。
9.遺傳毒性。
（四） 穩(wěn)定性研究與直接接觸性容器/材料研究
1.穩(wěn)定性研究
重組人源化膠原蛋白生產(chǎn)過(guò)程中間體如涉及到貯存，則需開(kāi)展相應(yīng)的穩(wěn)定性研究。采用擬貯存階段樣品的代表性批次開(kāi)展研究，一般包括貯存、運(yùn)輸（如適用）和使用穩(wěn)定性研究等。研究開(kāi)展前，需統(tǒng)籌制定穩(wěn)定性研究方案，關(guān)注各穩(wěn)定性研究所用樣品、直接接觸性容器/材料、檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)、檢測(cè)條件和分析檢項(xiàng)等。
研究中需對(duì)能夠反映質(zhì)量變化的敏感特征進(jìn)行研究，如含量、完整性、純度、微生物安全性和生物學(xué)特性等。需依據(jù)相應(yīng)的醫(yī)療器械產(chǎn)品的貯存運(yùn)輸條件開(kāi)展研究，涵蓋設(shè)定的各項(xiàng)條件，如溫度、光照、反復(fù)凍融（冷凍貯存時(shí)）、振搖等方面。根據(jù)實(shí)際使用情況，開(kāi)展使用中的穩(wěn)定性研究，例如復(fù)溶或解凍、與復(fù)溶稀釋劑的相容性研究等。研究中需采用與實(shí)際使用相同材質(zhì)的直接接觸性容器/材料。
2.直接接觸性容器/材料研究
如涉及貯存，需對(duì)直接接觸的包裝容器開(kāi)展相應(yīng)的包材相容性研究。根據(jù)相容性研究結(jié)果，結(jié)合穩(wěn)定性研究，選擇合理的包裝容器。
另外，對(duì)制備工藝中與樣品接觸的容器和一次性使用材料（如貯存袋、過(guò)濾膜、層析介質(zhì)、管路等），需開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和/或相應(yīng)的相容性研究。
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